活細胞DNA成像是指利用成像手段，對活細胞內(nèi)的DNA序列進行標記和觀察�；罴毎鸇NA成像常用于檢測基因組DNA在細胞核內(nèi)的定位分布和動態(tài)變化等特征，幫助人們了解這些特征與基因表達調(diào)控之間的關(guān)系，加深人們在基因組層面對細胞生命活動的認識。在醫(yī)療領(lǐng)域，活細胞DNA成像可以用來檢測細胞內(nèi)基因組DNA的拷貝數(shù)，有助于21-三體綜合征等染色體異常相關(guān)疾病的診斷。

日前，中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心研究員陳玲玲團隊開發(fā)了一種活細胞DNA成像新工具。團隊篩選并優(yōu)化了現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas12a，并基于此構(gòu)建了新型DNA成像系統(tǒng)CRISPRdelight。這一新工具可用于活細胞內(nèi)非重復(fù)DNA序列成像，為研究活細胞中DNA位點的空間位置和動力學特征提供了更加簡單便利的手段。相關(guān)研究論文在線發(fā)表于《自然·方法》雜志。

已有工具存在明顯局限

隨著能夠特異性靶向任意核酸序列的基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas被開發(fā)出來，基于該系統(tǒng)的活細胞DNA成像工具也在不斷迭代更新。

“當前，活細胞DNA成像工具的種類已經(jīng)十分豐富�！闭撐牡谝蛔髡摺⒅袊�科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心博士楊良中介紹，其中大部分工具都是從CRISPR/dCas9-EGFP（EGPF是一種熒光蛋白質(zhì)）系統(tǒng)衍生而來。這些已有的活細胞DNA成像工具分別從向?qū)�RNA的骨架結(jié)構(gòu)和表達質(zhì)粒構(gòu)建方式等方面，對原始系統(tǒng)進行優(yōu)化升級。

例如上�？萍即髮W研究員馬涵慧開發(fā)了DNA成像系統(tǒng)CRISPRainbow和CRISPR-Sirius，用于在活細胞中觀察基因組的三維結(jié)構(gòu)，并示蹤它們的動態(tài)變化。前者創(chuàng)造性地在向?qū)�RNA骨架結(jié)構(gòu)中引入了RNA適配體，用于標記DNA序列，并通過改變RNA適配體的類別，實現(xiàn)了不同DNA靶點的多色成像。后者則在此基礎(chǔ)上進一步做了優(yōu)化，通過增加RNA適配體的數(shù)目來提高成像質(zhì)量。北京大學教授陳匡時團隊開發(fā)的兩種DNA成像系統(tǒng)，則通過引入分子信標和熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像方法來提高DNA成像信噪比，以提升成像清晰度。

“目前較為成熟的系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了活細胞內(nèi)絕大部分重復(fù)DNA序列成像和多色成像，甚至在一定程度上實現(xiàn)了非重復(fù)DNA序列成像，但它們都存在明顯的局限性�！睏盍贾信e例說，比如一些系統(tǒng)，通過改進向?qū)�RNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建方式，將多條向?qū)�RNA表達元件放到同一個質(zhì)粒上，從而減少需要向細胞內(nèi)遞送質(zhì)粒的數(shù)目，增強成像效果。但將多個表達元件構(gòu)建到一個質(zhì)粒的方法步驟繁多、操作復(fù)雜，并不利于推廣使用。還有一些系統(tǒng)，通過將DNA的標記信號放大，實現(xiàn)一條向?qū)�RNA對目的序列的標記和成像。但僅利用一條向?qū)�RNA可能會存在標記脫靶的問題。

總而言之，在基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細胞DNA成像工具中，利用一條向?qū)�RNA標記DNA往往信號太弱或容易脫靶，要實現(xiàn)特異性非重復(fù)DNA序列成像或多色成像，需要表達多條向?qū)�RNA，通過多個靶點DNA信號的富集作用，才能實現(xiàn)對目的非重復(fù)序列成像。而如果讓每個表達元件只表達一條向?qū)�RNA，就會增加向?qū)�RNA表達元件的數(shù)量，提高成像的復(fù)雜度，降低成像效率�！叭绾胃咝�率、高質(zhì)量實現(xiàn)非重復(fù)DNA序列成像，一直是活細胞DNA成像領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)�！� 楊良中說。

新型系統(tǒng)更加簡便高效

與基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細胞DNA成像工具不同，此次團隊開發(fā)的新工具是基于基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas12a。這兩種系統(tǒng)都可以特異性靶向DNA，但CRISPR-dCas12a還能夠加工處理系統(tǒng)本身的CRISPR陣列，并生成成熟的向?qū)�RNA。

“我們開發(fā)的新型DNA成像系統(tǒng)CRISPRdelight正是利用了這一特點，通過表達一條能編碼多條向?qū)�RNA的轉(zhuǎn)錄本（即CRISPR陣列）來進行成像，而非單獨轉(zhuǎn)錄每條向?qū)�RNA�！睏盍贾薪榻B，這樣既實現(xiàn)了對靶點DNA信號的富集放大，又避免了系統(tǒng)復(fù)雜度增加。而且這一條轉(zhuǎn)錄本不僅可以編碼靶向同一DNA位點的向?qū)�RNA，也可以同時編碼靶向不同位點的向?qū)�RNA，實現(xiàn)多位點多色成像。因此，新系統(tǒng)更加簡便高效，容易通過增加向?qū)�RNA的數(shù)目提高成像質(zhì)量，大大降低了活細胞中非重復(fù)序列DNA成像的門檻。

與此同時，團隊利用新系統(tǒng)揭示了基因位點在細胞核內(nèi)的定位與其運動能力和轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)性，還實現(xiàn)了對4種活細胞內(nèi)衛(wèi)星DNA的多位點多色成像。

由于新系統(tǒng)具有簡便易操作等特點，楊良中認為，該系統(tǒng)未來有望應(yīng)用于需要進行活細胞DNA成像的實驗室，為活細胞中基因組DNA轉(zhuǎn)錄活性、DNA在細胞核內(nèi)的定位分布和動態(tài)變化特征之間的關(guān)聯(lián)性，以及等位基因之間表達調(diào)控的異質(zhì)性等研究提供助力，還能進一步幫助研究人員了解三維基因組在細胞核內(nèi)高度組織化的分子機制及其功能意義等。

非重復(fù)DNA序列成像和多位點多色成像是活細胞DNA成像長期面臨的兩大難題。如今，新系統(tǒng)的出現(xiàn)基本解決了非重復(fù)DNA序列成像的問題，但在活細胞DNA多位點多色成像方面，新系統(tǒng)仍有改進空間�！氨M管我們通過在新系統(tǒng)中引入RNA適配體實現(xiàn)了多個重復(fù)DNA序列的多位點多色成像，但是RNA適配體的引入在一定程度上影響了系統(tǒng)對CRISPR陣列的加工能力�！睏盍贾姓f，要實現(xiàn)多個非重復(fù)DNA序列的標記追蹤，未來還需進一步對CRISPRdelight進行優(yōu)化。